传统扩增子测序只能获得微生物的相对定量数据，无法全面准确的反映样本中的真实丰度情况。在用相对定量结果与表型数据进行关联时，研究者可能会推导出错误的结论，妨碍了人们对关键微生物信息的发掘。本方法基于添加人工合成内标，通过将系列已知拷贝数内标与样本DNA共同扩增及构建标准曲线，可在一次测序中同时获得微生物各分类群的相对丰度、绝对丰度和联合对比分析结果。该方法可以很好的解决传统相对定量方法的技术痛点，更加全面真实的反映样本中微生物的动态变化，结果更具生态与功能意义。

作为该项技术的专利拥有单位，昊为泰生物长期致力于微生物绝对定量检测技术的自主研发和各领域推广，在国内率先推出了昊为泰Accu16S^®细菌/AccuITS^TM真菌扩增子绝对定量测序、AccuMetaG^®宏基因组绝对定量测序，以及肿瘤内生菌绝对拷贝数、植物内生菌绝对定量测序等系列检测服务。此次iMeta文章的发表，也标志着昊为泰生物在微生物绝对定量检测领域实现了方法学上的重大突破和权威认可，为进一步引领我国微生物组学研究朝着更加精准定量方向发展提供了坚实的基础。

中文题目：Accu16S/AccuITS：一种准确且具有广泛适用性的微生物组扩增子绝对定量方法

发表时间：2026-3-2

文章亮点

1. 传统16S rRNA和ITS扩增子测序仅给出相对丰度，无法准确反映微生物真实丰度情况。

2. Accu16S/AccuITS 通过添加系列人工合成内标实现细菌和真菌扩增子的绝对定量。

3. 一次测序即可获相对与绝对丰度，提供更具生态和功能意义的分析结果，适用领域广泛。

文章解读

Accu16S/AccuITS 工作流程、原理及优势概述

Accu16S/AccuITS 流程是在标准微生物组分析基础上优化建立的绝对定量工作流程，支持多种样本类型，包括医学样本（如粪便、组织、拭子）、食品样本（如白酒大曲、发酵鱼）、环境样本（如海洋塑料、沉积物）、农业样本（如根际土壤）以及生态样本（如海拔或气候相关土壤微生物组）（图1A）。

在DNA提取之后，加入已知拷贝数的内标序列，并将微生物DNA与内标DNA共同扩增，用于16S rRNA或ITS的文库构建及高通量测序（图1B）。绝对OTU/ASV丰度通过基于内标reads构建的标准曲线进行计算。为便于下游分析，我们提供了shell脚本和分析流程，该流程可在GitHub上免费获取。

为验证Accu16S/AccuITS的准确性，我们将基于内标的方法与qPCR和ABI 3730进行比较，使用ZymoBIOMICS微生物群落（ZYMO）标准样本进行测试。Accu16S与qPCR表现出强相关性（图S1A），并且在腐殖酸抑制剂存在条件下表现出优于qPCR的稳定性（图S1B）。此外，在三个标准样本中，Accu16S获得的绝对定量结果与理论值、qPCR及ABI 3730测量结果一致（图S2；表S1），证实了该方法的准确性和稳健性。

Accu16S/AccuITS 的一个关键创新在于利用ABI 3730基因分析仪通过毛细管电泳测量 PCR 扩增产物的峰面积比例，用于验证内标与样本扩增产物之间的比例关系。结果表明，ABI 3730 检测得到的内标比例与终测序文库中获得的内标 reads 比例高度一致，说明内标在整个扩增与建库流程中保持稳定的扩增效率。这一结果进一步证明了基于内标构建标准曲线进行绝对定量的可行性与可靠性。

我们对24份真实土壤样本进行了测试，以评估该方法在复杂环境样本中的重复性与稳定性。结果显示，基于Accu16S 计算得到的16S rRNA基因拷贝数在重复样本之间保持高度一致，表明该方法在实际应用场景中具有良好的可重复性。

图1. Accu16S/AccuITS微生物绝对定量方法概述与优势。(A) Accu16S/AccuITS工作流程：在DNA提取后加入已知拷贝数的合成内标，与微生物DNA共同扩增，用于构建绝对定量标准曲线。(B) Accu16S/AccuITS分析微生物群落组成和估算绝对丰度的原理。(C) Accu16S/AccuITS的关键优势，包括高准确性、可扩展性和广泛适用性。

Accu16S/AccuITS在肠道、环境或食物微生物群中的应用

在应用层面，研究者将Accu16S/AccuITS方法应用于多个研究场景，以评估绝对定量与传统相对定量结果之间的差异（图2）。

医学研究领域，在糖皮质激素诱导的股骨头坏死小鼠模型中，研究者利用本方法比较了同笼与非同笼饲养条件下小鼠肠道微生物群的变化情况。结果显示，在相对丰度分析中观察到的某些菌属变化趋势，在绝对丰度分析中得到了进一步验证。例如，乳杆菌属（Lactobacillus）及L. animalis在疾病模型中均表现出显著下降，并且在绝对丰度层面下降幅度更加明显。这表明绝对定量能够更真实地反映微生物数量变化，为菌群与疾病之间的关联提供更有力证据。

在海洋生态系统研究中，研究者分析了不同水深条件下的微生物群落结构。相对丰度数据显示某些蓝细菌类群在表层水体中富集，而绝对丰度结果进一步揭示了这些类群随水深增加呈递减趋势。值得注意的是，绝对丰度变化趋势与宏转录组功能表达数据具有更高一致性，说明绝对定量结果更能反映真实的生态过程。

在食品酒类发酵研究中，研究者分析了白酒大曲发酵过程中微生物群落的动态变化。LEfSe分析结果显示，在相对定量与绝对定量数据之间，某些差异富集菌群的判定存在差异。当发酵过程中总微生物生物量发生明显变化时，相对丰度可能受到组成型数据约束的影响，而绝对定量能够更准确地识别真正发生扩增或减少的功能菌群。

此外，Accu16S/AccuITS 方法具有操作简便、成本相对可控、可兼容现有扩增子测序流程等优势。该方法无需额外复杂设备，仅通过在标准扩增子流程中引入已知拷贝数内标，即可实现绝对定量。由于内标与样本DNA共同扩增，因此能够有效校正PCR扩增效率差异及测序深度波动，提高跨样本之间的可比性。

图2. Accu16S/AccuITS在不同领域应用案例。(A,B) 在糖皮质激素诱导的股骨头骨坏死（ONFH）小鼠粪便样本中，Accu16S鉴定出关键分类群，绝对丰度和相对丰度在各组间呈现一致的趋势，支持结果的可靠性（Non-Ch和Ch分别代表非共饲养和共饲养小鼠，MPS和Vehicle分别表示有无甲泼尼龙处理）。(C) 在海水水体滤膜样品中，绝对定量与流式细胞仪测量的原核生物总数高度吻合，且优于基于相对丰度和转录本的方法。(D,E) 在大曲发酵中，基于Accu16S的绝对丰度和相对丰度分析产生了不同的细菌线性判别分析效应大小（LEfSe）结果，展示了绝对定量结果更具价值（LTDQ、MTDQ和HTDQ分别代表低温、中温和高温大曲）。(F,G) 在大曲发酵中， AccuITS在真菌LEfSe分析中揭示了相对丰度和绝对丰度之间的显著差异。红色箭头表示不同组的绝对丰度趋势

综上所述，本研究通过在扩增子测序体系中引入人工合成内标策略，实现了对微生物群落绝对丰度的检测。该方法在理论层面解决了相对定量组成型数据的固有限制，在实验层面验证了其准确性与稳定性，在应用层面展示了绝对定量在多种研究场景中的优势，适用于多种样本类型，涉及人体、农学、环境、食品发酵等应用领域。Accu16S/AccuITS 为微生物组研究提供了一种准确、可扩展且广泛适用的绝对定量解决方案，也为多组学联合分析提供更为准确的数据基础。

引文格式

Defeng Bai, Ou Fang, Caihua Li, Bin Cai, Xingyan Tan, Mengmeng Jiang, Bin Gan, et al. 2026. Accu16S/AccuITS: Accurate and Broadly Applicable Amplicon Sequencing for Absolute Microbiome Quantification. iMeta 4: e70116. https://doi.org/10.1002/imt2.70116